ACTO I – Iglesia Sant´Andrea della Valle.
Angelotti ha huido de la prisión y se refugia en la iglesia. Su hermana, la marquesa Attavantti, le había enviado un mensaje en el que decía que en la capilla familiar encontraría ropas para disfrazarse de mujer y poder huir de Roma. Llega el pintor Mario Cavaradossi para proseguir el trabajo con un cuadro, sólo piensa en su amada “Floria Tosca” una actriz y cantante de ardientes ojos negros. Angelotti deja su escondite, pero Cavaradossi le ve y se muestra dispuesto a ayudarle aescapar. Llega Tosca y, convencida de haber oído voces y ruidos extraños, monta una escena de celos. Finalmente acepta que sus celos atormentan a Cavaradossi y decide marcharse, calmada. Reaparece Angelotti y Cavaradossile ofrece su casa de campo, donde suele reunirse con Tosca, para refugiarse hasta que pueda abandonar el país. Reaparece Tosca deseando ver a Cavaradossi, y Scarpia le insinúa que el pintor se ha marchado con la dama del cuadro. Tosca, celosa, decide sorprenderlos en la casa de campo. Se inicia el Te Deum y todo el mundo se une a la plegaria general.
ACTO II – Palacio Farnese. Oficinas de Scarpia.
Sentado en su oficina del Palacio Farnese, Scarpiare flexiona sobre la búsqueda de Angelotti y acerca de sus deseos amorosos. Mientras. Spoleoa, muerto de miedo, trae la noticia de que Angelotti no ha sido hallado, pero se salva de las iras de Scarpia, al anunciar que han podido detener a Cavaradossi. Ordena a uno de sus esbirros que comience a torturarle para que confiese. En medio de la tortura llega Tosca, que,escuchando los gritos de dolor de su amado Cavaradossi cede a las presiones de Scarpia y confiesa dónde se halla oculto Angelotti.
Cavaradossi se da cuenta de que la tortura ha cesado gracias a la confesión de Tosca y la acusa de traidora. Llega Sciarrone para transmitir a Scarpia una grave noticia: Napoleón ha ganado la batalla de Marengo.Cavaradossi, no pudiendo contener su júbilo, exclama su fé en el próximo fin de la tiranía. Scarpia no puede consentir tales comportamientos y ordena que el prisionero sea preparado para ser inmediatamente ejecutado.
Quedan solos Scarpia y Tosca. El jefe de policía ofrece a Tosca la posibilidad de salvarla vida de su amado pintor a cambio de que ella ceda ante sus deseos amorosos.
Sus lágrimas y ruegos no le sirven de nada y se ve obligada a ceder: será suya, pero antes exige un salvoconducto para que ella y su amado puedan huir de Roma. Scarpia finge dar las órdenes oportunas a Spoleoa para que la ejecución de Cavaradossi sea sólo simulada. Scarpia, impaciente, quiere lanzarse ya sobre su víctima, pero antes Tosca exige el salvoconducto. Mientras Scarpia escribe, Tosca se apodera de un afilado cuchillo. La suerte de Scarpia está echada: Tosca aprovecha la ocasión para apuñalarlo en el pecho, coge el salvoconducto y se va después de haber puesto dos candelabros encendidos junto a la cabeza del cadaver de su mortal enemigo y un crucifijo sobre su pecho.
ACTO III – Terraza superior del castillo de Sant ́Angelo.
Amanece. Un pelotón trae a Cavaradossi. El carcelero le anuncia que todavía lequeda una hora de vida. A cambio de un anillo consigue el permiso de escribir unas palabras a una persona amada. Mientras escribe, lleno de nostalgia, vierte ardientes lágrimas que no pudieron arrancarle los atroces tormentos. Entra Tosca, se precipita hacia Cavaradossi, le enseña el salvoconducto y le cuenta todo lo sucedido, que la ejecución será simulada y que actúe con toda naturalidad cuando finjan fusilarlo. El pelotón dispara contra el preso. Mario se desploma sin un grito. Cuando se quedan solos Tosca se acerca a Cavaradossi, lo llama, intenta levantarlo, pero en vano: Mario está muerto.
Desde abajo se escuchan voces de terror: ha sido descubierto el cuerpo de Scarpia, y Spoleoa con ayuda de Sciarrone aparece para detener a Tosca. Pero Tosca no está dispuesta a dejarse coger. Rápidamente sube a la muralla del castillo y, dominada por una súbita decisión, se lanza al vacío.